Enzymatic Immunoassay ELISA


Ензимен имуноанализ (ELISA) - Modern лабораторни изследвания, в които избраните специфични антитела или антигени в кръвта на специфични заболявания за идентифициране не само етиологията, но също така и стадия на заболяването. Резултати от ELISA може да изглежда качествено и количествено.

Днес ELISA се използва в следните случаи:

1) Търсене на специфични антитела срещу инфекциозни заболявания;
2) антигени търсите някакви заболявания (инфекциозни венерически);
3) проучване на хормоналния статус на пациента;


4) изследване за туморни маркери;
5) изследване за наличие на автоимунни заболявания.

Ползи ELISA метод:

1) с висока специфичност и чувствителност на ELISA (над 90%).
2) умения за определяне и проследяване на динамиката на болестния процес, т.е. сравняване на броя на антителата в различни интервали от време.
3) Наличието на ELISA за диагностика във всяка медицинско заведение.

Относителната липса:

1) за откриване на имунния отговор (антитела), но не от патогена.

Основни понятия

Преди изясни същността на метода ELISA, за кратко се разбере някои понятия.

Антителата (или имуноглобулини - Ig) - Специфични протеини, произвеждани от B -
лимфоцити (имунни клетки) в отговор на хит в тялото на инфекциозни патогени (вируси, бактерии, гъбички и т.н.). Има имуноглобулин А (IgA), имуноглобулин Е (IgE), имуноглобулин М (IgM), имуноглобулин G (IgG), имуноглобулин D (IgD). Те се различават един от друг и образуват молекулна маса, полуживот, участие / без участие в инфекциозния процес, времето откриване след инфекция. Ако говорим за молекулно тегло, най-той IgM - това пентамерът (950 000 далтона) За разлика от други Ig (150-200 000 Yes), така че IgM просто не може да преминава през плацентарната бариера. Затова откриването на IgM при дете на 1 година живот винаги е признак на инфекция при плода. На серумните имуноглобулини, представени по-голямата част от него IgG (75-85%), а най-ниската - IgE (0003%). В инфекциозна процес само вземат пряко участие IgA, M, G. IgE е признак на алергични реакции и болести, както и IgD - може да се намери само в лимфните възли и сливиците тъкан, играе роля при формирането на местния имунитет.

На класове имуноглобулини

Antigens - Макромолекулни вещества от органичен произход, включително инфекциозни и други заболявания, както и различни вещества променени клетки, образувани от една или друга болест (автоимунни заболявания, онкология).

Имунен комплекс - Антиген-антитяло комплекс, който участва в имунния процес.

Какъв метод на базата ELISA.

Има няколко разновидности на ELISA (преки, непреки метод за блокиране, конкурентни), но на практика често се използва хетерогенна твърда фаза имунен анализ или ELISA (ензимно свързан имуносорбентен анализ)

База ELISA имунен отговор е антиген и антитела, за да се образува имунен комплекс: антиген-антитяло, което води до промяна на ензимната активност на специфични маркери на повърхността на антитела.

Методът IFA

По-просто казано, този процес може да бъде разделен на няколко етапа:

1) повърхностни дупки таблетка лекар изпитващ е пречистен антиген специфичен патоген. Чрез добавяне на биологичен материал (кръв, серум) е специфичен пациент реакция между антигена и желаното антитяло (имуноглобулин). Тази връзка ще действа като "специален антиген" в следващия етап.

2) На този етап е образуването на IR (имунни комплекси) - реакцията между "специфичен антиген" и конюгат (това имуноглобулин белязан с пероксидаза ензим). Специално се добавя хромоген. В резултат на тази ензимна реакция е образуването на оцветени вещества в отвора на таблетката, интензитетът на цвета зависи от количеството, съдържащо се в материала на имуноглобулини (антитела) пациенти.

3) След това, общият резултат: fotometryrovanye използвайки многоканална спектрофотометър, сравнявайки се оптическата плътност на материала тестовете оптична плътност за контрол на изпитвания, математически резултати за обработка. Брой на антитела в пациент зависи от височината на оптичната плътност на ямките.

Обикновено в практиката, като се използват 96-ямкови плаки.

При измерване на оптичната плътност (ОП) се брои броя на течността за изпитване (или концентрация) на антитяло в определен обем единица. Резултатите се сравняват с контролна проба.

Трябва да се помни:за всяка тестова система разработена индивидуални показатели за счетоводни резултати, норми за ефективност и патология (т.е. "референтна стойност"). Това трябва да се има предвид при оценяването на резултатите от всяко отделно проучване. Неправилно тълкуване на резултатите от една лаборатория на "референтни стойности" друга лаборатория. Неправилно е да се сравняват резултатите от различни лаборатории от един на друг.

При определяне на ELISA реакции и важни понятия като ненаситност антитяло.
Авидитет антитела - Това е силата на връзката, с антиген и антитяло и антиген количеството, което е във връзка с immnohlobulinami (антитела). Ненаситеността е важно при оценката на прогнозира време на инфекция, която е изключително важно при диагностицирането на първична инфекция при бременни жени.

В основата на тест ненаситеност антитяло се състои от обработката на имунен комплекс (антиген-антитяло) разтвор на урея да унищожи протеина. Vysokoavidni връзка останат непокътнати и nyzkoavidnyh унищожени. Резултатът се дава под формата на индекс ненаситеност, изразен като процент (%).

Какви заболявания се открива чрез ELISA диагностика?

1. Инфекции
1.1 вирусен хепатит А (IgM, G), B антигени -HBsAg, HBeAg, антитяло - IgM HBcorAg, Ig общия HBcorAg, IgG HBeAg), C (антитела Ig M, G HCV), D (IgM, G), E (Ig М, G) и други.
1.2 HIV инфекция (IgG)
1.3 Tsytomehalovyrusnaya инфекция (IgM антитела, G)
1.4 Епщайн-Бар вирусна инфекция или mononkleoz (антитела IgM, G да EA, VCA, Na протеини на вируса)
1.5 херпесни инфекции (IgM антитела, G)
1.6 Токсоплазмоза (антитела IgM, G)
1.7 рубеола (IgM, G)

1.8 Морбили (IgM, G), бруцелоза (IgM, G), pseudotuberculosis (IgM, G), salmonellezom (IgM, G), Shyhellez или дизентерия (IgM, G), аспергилоза (IgM, G), пренасяни от кърлежи енцефалит и борелиоза много други.
1.9 паразитози (Жиардиаза, toxocarosis, трихинелоза, opisthorchiasis, ехинококоза, alveokokkoz и други), в която IgG открито
1.10 STD (болести, предавани по полов) - микоплазмоза (IgM, G), ureaplasmosis (IgM, G), Chlamydia (IgA, М, G), сифилис (IgG)
1.11 Pylori инфекция (IgG)

2. маркери на автоимунни заболявания и имунните параметри на човека (общ IgE, IgG общо, общо IgA, IgM общо, общо IgD, секреторна IgA, IgG 2, IgG4, CEC-циркулиращи имунни комплекси, IgA и IgG да глиадин и т.н.)

3. Onkolohichsekie маркери (TNF - тумор некротичен фактор, CEA - карциноембрионален антиген, PSA - prostatspetsyfichnyy антиген ЧХГ - човешки хорионгонадотропин, CA 125, alveomutsin и много други)

4. репродуктивни разстройства (естрадиол, прогестерон, пролактин, тестостерон, AFP- alfafetoproteyn, FSH - фоликуло-стимулиращ хормон и други)

5. щитовидната жлеза (свободен и свързан T3, T4, тиреоглобулин, tireoperoksidaze - TPO, Тиреотропин - TSH).

Този списък се представя не всички болести са диагностицирани чрез ELISA.

Материал за ELISA анализ и правила на оградата

Най-често срещаният материал за ELISA реакции - кръвния серум на пациента, се приема на празен стомах. Материалът може да служи като гръбначно-мозъчната течност, амниотична течност, стъкловидното тяло съдържание, слуз шийката на матката и уретрата, тампони.

Подготовка на пациентите за доставка на материали за ELISA

Кръв се взима на празен стомах. Преди каквато и кръв не трябва да взимате лекарства. Специализирано лечение (антибактериално, антивирусно, protyvoparazytarnoe и т.н.) трябва да спре най-малко 2 седмици преди проучването.

Условия IFA производство

Enzymatic Immunoassay материал е бързо, за една нощ. Забавянето може да бъде в различни лаборатории поради натрупването на редица серуми.

Възможни резултати от ELISA диагностика

При оценката на резултатите на специфични инфекции важен клас антитела и техния брой. На тази зависи не само етиологията на инфекция (или не са), но също така предсказуема етап на заболяването (остра, хронична), и наличието на активна инфекция (остра или обостряне на хронична) по време на изследването.

Какви са приблизително времето на появата на антитела (имуноглобулини - Ig)?

Най-ранните антителата са IgM. Идентифицирайте те могат да бъдат 1-3 седмици след евентуалното заразяване, характеризиране на острата фаза на инфекцията. Втората ситуация е появата на антитела IgM - активиране (или влошаване) на хроничен процес. IgM антитела циркулират средно около 3 месеца, след което броят им постепенно изчезва. Въпреки това, при някои пациенти, следи от IgM могат да възникнат в рамките на 1-2 часа години инфекция.

Съвременните системи за тест с висока чувствителност, в резултат на фалшиви положителни резултати са неспецифични (често при бременни жени). Ето защо, в тази група пациенти положителен IgM трябва да се тества!

IgA антитела се появяват 2-4 седмици след инфекцията, но в количество, достатъчно да се определи - за един месец. Serum IgA синтезира от плазмени клетки на далака, лимфните възли и лигавиците, секреторни IgA съсредоточени в лигавиците да изпълнява своята защитна функция - участие в местния имунитет.

От четвъртата седмица след заразяването започват да се появяват антитела IgG. В повечето инфекции титър постепенно се увеличава от максимум по различно време (средно 1.5-2 месеца), а след това титър остава на ниско ниво и точки за имунната система. В някои заболявания (микоплазмоза, хламидия, трихомониаза) ниво IgG не е висока, намалява значително поради липса на имунитет в тези инфекции.

Опции за откриване на антитела от различни класове:

- Изолирани откриване IgM антитела предполага, че първичните

инфекция.
- Едновременно откриване на IgM и IgG кръвното типични за първична инфекция
през последните 2-3 месеца, както и обостряне на хронична болест. По този начин, наличието на IgM по време на бременност не винаги е признак на първичната инфекция.
- Идентификация на изолирани IgG може да посочи как имунитет към болестта,
и хронична инфекция. Във втория случай е важно и броя на антитела (титър) и промяна на динамиката титър. Обикновено, проучвания, проведени през интервал от 2-4-6 седмици.

- Откриване на IgA или IgM изолация посочи първична инфекция. При
появата на IgA с IgG очаква активиране на хронична инфекция (средно две седмици от датата на влошаване).

Определяне на ненаситеността IgG антитела е отличен допълващ етап диагноза първична инфекция от стария инфекция, която има своя клинично значение, особено при оценката на риска от вътрематочна инфекция на плода. Откриване на IgG nyzkoavidnyh показва първичната инфекция и са средно 4-6 месеца след инфекцията, рядко по-дълго. Nyzkoavidnyh IgG изисква друго лабораторно доказателство за първична инфекция (IgM). Vysokoavidni антитяло е било признак на хронично заболяване и неговото изостряне, или формира имунитет.

Особености при бебета:деца до една година, а понякога и 1,5 години в кръвта на майката циркулира IgG към инфекции (това беше проникването им през плацентата от майката на плода в утробата). Това не е само по себе си е признак на инфекция присъства. Ако възрастта на takjm са IgM (Припомняме, че на майките IgM проникнат през плацентата не може), а след това е признак на инфекция на плода или инфекция, придобита след раждането.

Количествен метод ELISA

Резултатът от ELISA диагностика (като се използва ELISA анализатор) се появява в определени единици:
- Оптичната плътност (ОП) пробата - концентрация на специфични антитела в единица обем. По-високите проби ОП, по-високата концентрация на антитела. Някои резултати се отнася до съотношението на позитивност (СР) - това е оптичната плътност на пробата.
- Дялове на концентрация на антитела (nanohramm / милилитър, или нг / мл).
- След серумни титри: 1:20, 1:40, 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1200 и така нататък. Диагностични титри (при което болестта е диагностицирана, а не фактът на инфекция) за различни заболявания са различни.

- Под формата на символа - "+", "-", (+, ++, +++, ++++) "?".
- В качествена оценка на даден критерий (положителен или отрицателен).

Правилно се изчисли количеството на откриване антитяло на вариант IgG клас и следователно определи стадия на заболяването и необходимостта от лечение може само лекар.

Не трябва да забравяме, че за всяка тестова система разработена от техните "референтни стойности" (правила вариант), над която и диагностицирани определено заболяване (варианти патология). За различните системи за изпитване "референтни стойности" са различни.

Коректните сравняване на резултатите на IFA, взети в динамика, възможно само в случай на производство в същата лаборатория.